Aminosäureanalyse –
Anleitung zum Derivatisierungskit von Bioananlytics Gatersleben
Der Kit wird in fünf Flaschen, geliefert: RG-I, 1 bis 5; RG-II, 1 bis 5 und RG-III, 1 bis 5. Die Analyse von bis zu ca. 250 Aminosäureproben ist möglich.
Zur Fluoreszenzmarkierung der Aminosäuren wird eine selbst hergestellte, reine fluoreszierende Verbindung – 6-Aminochinolyl-N-hydroxysuccinimidylcarbamat (AQC) – zur Vorsäulen-Derivatisierung eingesetzt. Die vorbereiteten Proben werden auf die Ultra-High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) geladen. Die gewünschten Aminosäuren werden auf der entsprechenden Säule getrennt und mit einem Multiwell-Fluoreszenzdetektor nachgewiesen. Eine Analyse ist innerhalb von sechs Minuten möglich, und die Konzentrationen werden auf Basis interner Standards berechnet. Qualität und Zuverlässigkeit der detektierten Aminosäuren werden durch den Einsatz von Standards überprüft.
Sowohl primäre als auch sekundäre Aminosäuren und Amine reagieren spontan mit AQC und bilden hochstabile, fluoreszierende Derivate. Das überschüssige Reagenz reagiert mit Wasser und bildet ein freies Amin.
1) Vorbereitung der Fluoreszenzlösung
-
Zunächst sollte ein Wasserbecken auf 55°C erwärmt werden
-
Zur Vorbereitung des Fluoreszenz-Reagenz wird von der Lösung RG II 1 ml zu dem Pulver RG III gegeben
-
Die Gemischlösung wird für 15 Sekunden geschüttelt …
… und anschließend für genau 10 Minuten bei 55°C im vorgewärmten Wasserbecken inkubiert
2) Probenvorbereitung
-
Nach 10 Minuten wird das rekonstituierte AQC-Reagenz für die Derivatisierung der Proben eingesetzt.
Dazu werden 160 µl unseren RG I-Derivatisierungspuffers in ein 1.5 ml Eppendorfgefäß vorgegeben
-
Jeweils 20 µl extrahierte Aminosäuren aus dem Probenmaterial oder vorbereitete Standardgemische hinzugefügt
-
Jeweils 20 µl aus der oben vorbereiteten Reagenzlösung RG II werden zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 200 µl zu erhalten
-
Das gesamte Gemisch wird nun für 10 Sekunden auf dem Vortex geschüttelt
-
Alles wird dann exakt für 10 Minuten bei 55°C unter leichtem schütteln (300 rpm) inkubiert
-
Nach der Inkubation werden die Proben für 15 Sekunden bei 13000 rpm zentrifugiert
-
Die nunmehr zentrifugierte Lösung wird komplett in eine geeignete Mikrotiterplatte eingeführt und für die Analysen verwendet.
In der Regel können bis zu 96 Proben in einer Mikrotiterplatte gleichzeitig analysiert werden.
3) Chromatographische Trennung
-
Bei uns werden dir Proben auf der modernen UPLC-Anlage analysiert. Wir verwenden unsere eigenen entwickelten Eluenten A und B und der Säule eines Markenanbieters, die eine lange kostengünstige Haltbarkeit gewährleistet.
-
Die Probenplatte wird in die auf 8°C vorgekühlte HPLC / UPLC Anlage plaziert.
Wir erhalten mit unserem Kit auf der UPLC Anlage in 6 Minuten die fertige Chromatographenanalyse.
4) Ergebnis
Die Abbildung zeigt das Profil von zwanzig essentiellen und nicht-essentiellen Aminosäuren, aufgenommen mittels UPLC in Kombination mit einem Fluoreszenzdetektor. Im oberen Teil ist die Trennung der 20 Aminosäuren auf einer C18-Säule dargestellt, während der untere Teil die Analyse derselben Aminosäuren in einem Gersteblatt zeigt. Die entsprechenden Konzentrationen der Proben wurden anhand einer Standardkurve berechnet. Auf der X-Achse ist der zeitliche Verlauf der Analyse über 6 Minuten dargestellt, die Y-Achse gibt die Fluoreszenzintensität wieder, die die gemessene Energie repräsentiert.
Damit wird deutlich, dass Gersteblätter ein spezifisches Aminosäureprofil aufweisen, in dem insbesondere Serin (Ser), Glutamin (Gln) und Glutamat (Glu) dominieren.
Vorzüge der Analysen durch Bioanalytics Gatersleben
- Der günstige Preis umfasst alle notwendigen Kosten für Ausrüstung und Verbrauchsmaterialien.
- Die Analyse beginnt mit kostenlosen Testproben, um die optimale Konzentration zu ermitteln.
- Die Hauptanalysen werden von erfahrenen Wissenschaftlern durchgeführt, mit individuellen Standards verifiziert und in einem Abschlussbericht dokumentiert.
- Es werden Chromatogramme der Standards und Proben erstellt.
- So erhalten Sie in kürzester Zeit einen präzisen Aufschluss über die Aminosäurebestandteile Ihres Probenmaterials.
- Unter Verwendung interner Standards werden die Konzentrationen der einzelnen Aminosäuren quantifiziert.
- Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden, wie der HPLC (High Performance Liquid Chromatography), die häufig keine saubere Trennung der Aminosäuren ermöglicht und zu Überlappungen wichtiger Substanzen wie GABA (Gamma-Aminobuttersäure) und ACC (Aminocyclopropancarbonsäure) führt, liefert unsere Methode exaktere Ergebnisse. Die Analysezeit mit HPLC liegt in der Regel zwischen 30 und 60 Minuten.
- Mit der UHPLC-Methode anderer Anbieter erhalten Sie Ihr Ergebnis in circa 11 Minuten. Unsere Gesamtanalysezeit beträgt sechs Minuten.
- Die Kombination von Eluenten und Säulen der Bioanalytics Gatersleben tragen zu einer Kostenersparnis bei und verkürzten Analysezeit bei.
Nachteile selbst durchgeführter herkömmlicher Analysen
- Personalkosten: Es entstehen hohe Kosten für geschultes Personal, das für die Durchführung und Auswertung der Analysen erforderlich ist.
- Bestellung des Derivatisierungskits über andere Anbieter: Hohe Kosten, zusätzliche Bestellvorgänge und Lieferzeiten verlangsamen Prozesse und Abläufe.
- Teure Säulen und Vorsäulen: Die Kosten für hochwertige Trennsäulen und Vorsäulen sind hoch und sind eine wirtschaftliche Belastung dar.